A. Pengertian
pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram adalah jenis pewarnaan yang penting dan
paling umum digunakan untuk membedakan antara bakteri gram positif dan bakteri
gram negatif. Pertama kali diperkenalkan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
pewarnaan Gram, bakteri-bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif
dan Gram negatif. Gram positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama
“kristal violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah
jambu karena melepaskan zat warna utama dan menangkap zat warna penutup
”fuchsin”. Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :
1. Pewarnaan dengan zat warna
utama (kristal gentian violet yang warnanya violet).
2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan
suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol.
3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan
peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam.
4. Pemberian zat penutup (counter
stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin, dll.
Pulasan menurut
Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya terdapat pada
”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama memberikan zat-zat
warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-positif dapat menjadi Gram
negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol juga dengan melakukan pemulasan
terhadap bakteri yang telah diketahui Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang
digunakan senantiasa diperiksa, apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran
lainnya. Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan
kertas saring.
Perlu kita
ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan bakteri tadi, tidaklah
absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga pada beberapa faktor,
antara lain:
a) Bakteri-bakteri
Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat
preparat dari bakteri-bakteri biakan murni yang telah tua (rough).
b) Ada
bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang mengalami
sedikit perubahan.
c) Selain daripada
itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”, dll.
Gentian violet
dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika gentian violet tidak
ada.
B.
Tujuan Pewarnaan Gram
Menurut Waluyo (2008), tujuan dari pewarnaan adalah :
1.
Memudahkan melihat
mikrobe dengan mikroskop
2.
Memperjelas ukuran
dan bentuk microbe
3.
Melihat struktur
dalam bakteri , seperti dinding sel dan vakuola
4.
Menghasilkan
sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna
C. Prinsip Pewarnaan Gram
Saat bakteri diwarnai dengan zat
pewarna primer (kristal violet), bakteri gram positif akan menyerap zat warna
tersebut sehingga berwarna ungu. Sedangkan bakteri gram negatif akan melepas
zat warna (kristal violet) setelah dicuci dengan alkohol dan kemudian akan
menyerap zat warna terakhir yang diberikan yaitu safranin atau fuchsin sehingga
berwarna merah.
Alat dan Bahan
•
Kristal violet / Gentian violet
•
Lugol
•
Alkohol
•
Safranin / Karbol Fuksin
•
Air
•
Kaca Objek
•Ose
• Api Spirtus
• Api Spirtus
D. Komposisi
Cat Gram
1.
Cat Gram A
Berwarna ungu karena mngandung kristal violet. Cat gram A
merupakan cat primer yang akan memberikan warna mikroorganisme target.Semua
mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai cat warna cat gram A.
Komposisi :
Kristal violet
: 2 gram
Alkohol 95%
: 20 ml
Aquadest
: 80 ml
Amonium oksalat : 0,8 gram
2.
Cat Gram B
Cat gram B berwarna coklat. Cat ini merupakan cat mordan,
yaitu cat/ bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap
mikroorganisme target. Pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih
kuat) .
Komposisi :
Iodium
:1 gram
Kalium iodida : 2 gram
Aquadest : 300ml
3.
Cat gram C
Cat gram ini tidak berwarna / bening. Berfungsi untk
melunturkan warna cat sebelumnya .akibat pemberian warna
tersebut :
a.
Mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol, ikatan antar cat dengan bakteri
tidak dilunturkan dengan alkohol.bakteri yang demikian dinamakan bakteri gram
positif.
b.
Mikroorganisme akan tidak berwarna,
karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri
dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dinamakan bakteri gram
negatif.
Komposisi:
Aceton
: 50 ml
Alkohol 95% : 50 ml
4.
Cat Gram D
Merupakan cat skunder atau kontras. Cat ini berwarna merah
berfungsi sebagai pemberi warna mikroorganisme non target.Cat Skunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer.
Akibat pemberian cat gram
D :
a. Bakteri gram positif akan tetap berwarna ungu karena tidak
jenuh mengikuti cat gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat gram D.
b. Bakteri gram negatif berwarna merah karena cat sebelumnya
telah dilunturkan oleh cat gram C, maka akan mampu mengikat cat gram D
Komposisi :
Safranin : 0,25 gram
Alkohol
95%
: 10 ml
Aquadest
: 90 ml
E. ProsedurKerja
1.
Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan
(fiksasi) 3x di atas api Bunsen.
2.
Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah
sediaan dingin), biarkan selama 5 menit.
3.
Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant
(lugol), diamkan selama kira-kira 1-3 menit.
4.
Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol
96%, sampai warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur lagi).
5.
Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi
dengan cat-penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2
menit.
6.
Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar,
lihat dengan mikroskop memakai lensa perbesaran 100x +
minyak emersi.
Interpretasi Hasil:
Gram (+) warna merah
Gram (-) warna ungu
F. Analisa
Menurut Hadieotomo (1988), bakteri dapat
dipisahkan secara umum 2 kelompok besar yaitu:
1) Organisme
yang dapat menajahan kompleks pewarna primer ungu kristal iodium sampai pada
akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram positif.
2) organisme yang kehilangan kompleks warna ungu
kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh
pewarna tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut Gram negative.
G.
Perbedaan gram positif dan gram negatif
Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa
komposisi dinding sel bakteri Gram positive berbeda dengan bakteri Gram
negative. Dinding sel yang lebih yang tebal pada bakteri Gram positive menyusul
oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel Gram
negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan
lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh dari Gram positive
adalah S.aureus dan Gram negative adalah E.coli.
Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram
positive dan Gram negative sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam
permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding
sel bakteri Gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel
bakteri Gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan
dinding sel bakteri Gram negative (Lay,1994).
H. Contoh
bakteri yang dapat di identifikasi dengan pewarnaan Gram
Gram Positif :
Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Actinomyces, Bacillus, Enterococcus,
Gardnerella, Lactobacillus, Listeria, Mycoplasma, Nocardia, dll.
Gram Negatif : Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae yang lainnya, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter,
Bdellovibrio, Acetic acid bacteria, dll
Sekian, semoga bermanfaat ;)
Sumber :
Diakses pada Jumat,30 Maret 2018 pukul 21.00
Diakses pada Jumat,30 Maret 2018 pukul 21.30 WIB
Diakses pada Jumat,30 Maret 2018 pukul 21.45 WIB
Diakses pada Jumat,30 Maret 2018 pukul 22.00 WIB
Tidak ada komentar:
Posting Komentar